Igazgató: Prof. PÉCZ Béla D.Sc., H-1525 Budapest, Konkoly-Thege M. út 29-33, Tel.:+361-3922225, Fax:+361-3922226
MFA Nyári Iskola Középiskolásoknak

A jelentkezéssel kapcsolatos információk ITT.

KALAS Benjamin #11D - ELLIPSZOMÉTERES MÉRÉSEK - Fehérjerétegek előállítása és optikai minősítése személyes HONLAP
Témavezető 1.: KALAS Benjamin, Tel.:392-2222-2502, Épület:26, Szoba:223, E-mail:emegir@gmail.com, GEarth:(KFKI_26)

Fehérjék hordozó felületre történő leválasztása (adszorpciója) és folyadék/szilárd határfelületen történő viselkedése, stabilitása, strukturális átrendeződése számos kutatási terület központi témája. Például biokompatibilis anyagok, bioszenzorok fejlesztésénél elengedhetetlen a fehérjék e felületi jellemzőinek tanulmányozása, ismerete.

Fiziológiás körülmények többnyire folyadék közegben játszódnak le, így célszerű a fehérjék adszorpcióját is folyadék fázisban vizsgálni. Így a bioszenzorikai kutatásoknál is a felületi reakciók általában folyadékban történnek. Ezeket alapul véve célunk különböző fehérjék adszorpciójának tanulmányozása és így a szilárd hordozón kialakított struktúráinak a megismerése.

Bioszenzorikai alkalmazási lehetőség:
A baktériumok mozgásszerve a flagellum (1. ábra), mely sejten kívüli része az 5-20 mikrométer hosszúságú, 23 nanométer átmérőjű, flagellin fehérje alegységekből felépülő flagelláris filamentum. Ezek a filamentumok különösen alkalmasak arra, hogy belőlük - meghatározott célmolekulák hatékony felismerésére és megkötésére képes - mesterséges receptorok legyenek előállíthatók. A flagellinek jól meghatározott régióit kódoló génszakaszokat irányított evolúciós eljárással módosítják, majd az így kapott mutáns géneket hordozó baktériumokat tenyésztik. Ezek filamentumait már a módosított receptor flagellinek alkotják. E mutáns fehérjeszálakat - a sejtekről való leválasztásuk után - alkalmas mérőchip felületére rögzítik. Mivel már egyetlen filamentumot is több tízezer receptor flagellin alkot, és ilyen szálakból hatalmas mennyiséget köthetünk ki a nanochipek felületére, rendkívüli érzékenységgel bíró szenzorokat gyárthatunk.

baktérium filamentumokkal filamentum részlete kinagyítva filamentum fehérje alegysége
1. ábra. Balra egy baktérium és a mozgásához használt flagelláris filamentumok láthatóak. Középen a filamentum egy kinagyított részlete, jobbra pedig az látható, hogy milyen fehérje egységekből (monomer) épül fel egy filamentum.

A kutatási fázisban lévő bioszenzorok fejlesztésénél szükséges, hogy a receptor réteg szilárd felületen (nanochipen) kialakított struktúráját, stabilitását és szelektív kötőképességét megismerjük. Jelen példa esetében a flagelláris filamentumok felületre történő leválasztásának és a felületi elrendeződésének tanulmányozása, jellemzése fontos lépés a későbbi alkalmazások irányába.

Fehérjeoldatot szilárd hordozón áramoltatva a fehérje molekulák a felületre áramlanak, diffundálnak, majd a felületet elérve arra letapadnak. A felület és a fehérje fizikai, kémiai tulajdonságaitól függően köztük gyenge másodlagos vagy erősebb kovalens kötés is kialakulhat. Ahhoz, hogy a letapadt fehérjék következtében a felületen végbemenő változásokat nanométeres (1 nm = 10-9 m) tartományban is pontosan tudjuk detektálni, nagyon érzékeny mérési eljárásra van szükség. Továbbá célszerű a fehérje adszorpció folyamatát időben, és a fentebb említett okok miatt folyadék közegben nyomon követni. Ehhez a mérések során olyan optikai módszert alkalmazunk, mely folyadékcella használatával képes a felületen bekövetkező változásokat folyamat közben (in situ) érintés- és roncsolásmentesen detektálni. A spektroszkópiai ellipszometria (SE) alkalmas ilyen in situ vizsgálatokra.

Woollam M2000DI spektroszkópiai ellipszométer
2. ábra. Az MFA Ellipszometria Laboratórium (www.ellipszometria.hu) Woollam M2000DI spektroszkópiai ellipszométere.

Az ellipszométer egy olyan mérőberendezés, mely a minta felületről visszavert fény polarizációs állapotának a megváltozását tudja kimérni. Amikor a fény két eltérő törésmutatójú közeg határfelületéről verődik vissza, polarizációs állapota megváltozhat. Ennek mértéke e két közeg anyagi minőségének függvénye. Az ellipszométer ezt a polarizációváltozást méri. A laboratóriumunkban használt Woollam M2000DI spektroszkópiai ellipszométer (2. ábra) pontosságáról tipikusan elmondható, hogy segítségével a vizsgáló fény hullámhosszának ezredével összemérhető vékonyréteg-vastagságok még nagy pontossággal detektálhatóak. Alkalmasan kidolgozott réteg modellek segítségével meghatározható a felületre letapadt (adszorbeált) nanométeres vastagságú fehérjeréteg számos fizikai tulajdonsága (réteg vastagsága, optikai sűrűsége) is. Ezen információk ismeretében már a felületre letapadt összes anyagmennyiség is kiszámolható. Tehát az SE módszer alkalmazása olyan felületanalitikai és minősítő eljárás, mely kulcsa a megbízható, reproduktív szenzorchipek kifejlesztésének.

A mérések során többnyire szilícium mintát használunk, melyet az ellipszométer tárgyasztalára helyezünk. A mintára olyan kisméretű (0,2 ml térfogatú) folyadékcella rögzíthető, amelyben a fehérjeoldatot perisztaltikus pumpával áramoltatva, a minta felületén történő változások a mérés kezdetétől a végéig folyamatosan nyomon követhetőek. A folyadékcellát (3. ábra) az ellipszométer tárgyasztalán úgy állítjuk be, hogy a beeső fénynyaláb a cella első ablakán átjutva megvilágíthassa a benne található mintát, majd erről visszaverődve a másik ablakon át a detektorba jusson.

folyadékcella 3D képe Kretschmann folyadékcella
3. ábra. Balra látható a folyadékcella 3D képe, jobbra pedig pedig egy úgynevezett Kretschmann elrendezésű, amelyben az üveg hordozó felől udunk mérni plazmon rezonancia erősítést használva.


Érdemes tehát a hordozórétegre történő fehérjeleválasztást folyadékcellában végezni. Így sokkal részletesebb képet kaphatunk az immobilizációs eljárásról, és egyúttal annak paramétereit is tovább pontosíthatjuk.

Az MFA Nyári Iskola ideje alatt a diák kutatónak lehetősége lesz megismerkedni egy bio-nanotechnológiai kutatási irányzattal, melynek célja érzékeny bioszenzorok fejlesztése. Saját kezűleg készítheti el a mérésekhez szükséges oldatokat, lépésről-lépésre nyomonkövetheti az előkészítési folyamatokat. Majd az így elkészített mintákkal, oldatokkal dolgozva nanométeres tartományba eső felületi változást tud megfigyelni érzékeny optikai módszerekkel. A mérések során a spektroszkópiai ellipszométer beállításait, a folyadékcella pozícionálását számítógépen keresztül fogja vezérelni, majd a mérést optikai modellek megalkotásával kiértékelni.



FELADAT: Az MFA Nyári Iskolában a konkrét feladat fehérjerétegek leválasztása és optikai minősítése lesz.

TERVEZETT PROGRAM:
  • Mérési előkészületek: szilárd hordozók tisztítása, fehérjeoldatok elkészítése, folyadékcella megismerése és tisztítása
  • Ellipszométer működésének megértése és használatának elsajátítása, majd a mérés során fehérjerétegek leválasztásának nyomon követése számítógépen
  • Kiértékelés: A felületre leválasztott fehérjeréteg optikai minősítése és jellemzése az ellipszometriai kiértékelés alapján


  • OLVASMÁNYOK:
  • http://www.ellipsometry.hu/Ellipszo-labor-anyag.pdf
  • http://webphysics.davidson.edu/physlet_resources/dav_optics/Examples/polarization.html




  • ELÉRHETŐSÉGEK:
    Témavezető: KALAS Benjamin, Tel.:392-2222-2502, Bp. XII. Konkoly-Thege M. út 29-33, Épület:26, Szoba:223, E-mail:emegir@gmail.com, GEarth:(KFKI_26)

    Utolsó frissítés: Mon, 22 May 2017 19:03:08 GMT, Számláló: