 |
#11b - ELLIPSZOMÉTERES MÉRÉSEK - Fehérjerétegek előállítása és optikai minősítése
személyes HONLAP
Témavezető 2.: FODOR Bálint, Tel.:392-2222-1693, Épület:26, Szoba:215,
E-mail:fodor@mfa.kfki.hu,
GEarth:(KFKI_26)
|
Fehérjék hordozó felületre történő leválasztása (adszorpciója) és folyadék/szilárd határfelületen történő viselkedése,
stabilitása, strukturális átrendeződése számos kutatási terület központi témája. Például biokompatibilis anyagok,
bioszenzorok fejlesztésénél elengedhetetlen a fehérjék e felületi jellemzőinek tanulmányozása, ismerete.
Fiziológiás körülmények többnyire folyadék közegben játszódnak le, így célszerű a fehérjék adszorpcióját is
folyadék fázisban vizsgálni. Így a bioszenzorikai kutatásoknál is a felületi reakciók általában folyadékban történnek.
Ezeket alapul véve célunk különböző fehérjék adszorpciójának tanulmányozása és így a szilárd hordozón kialakított
struktúráinak a megismerése.
Bioszenzorikai alkalmazási lehetőség:
A baktériumok mozgásszerve a flagellum (1. ábra), mely sejten kívüli része az 5-20 mikrométer hosszúságú,
23 nanométer átmérőjű, flagellin fehérje alegységekből felépülő flagelláris filamentum. Ezek a filamentumok
különösen alkalmasak arra, hogy belőlük - meghatározott célmolekulák hatékony felismerésére és megkötésére képes -
mesterséges receptorok legyenek előállíthatók. A flagellinek jól meghatározott régióit kódoló génszakaszokat
irányított evolúciós eljárással módosítják, majd az így kapott mutáns géneket hordozó baktériumokat tenyésztik.
Ezek filamentumait már a módosított receptor flagellinek alkotják. E mutáns fehérjeszálakat - a sejtekről való
leválasztásuk után - alkalmas mérőchip felületére rögzítik. Mivel már egyetlen filamentumot is több tízezer receptor
flagellin alkot, és ilyen szálakból hatalmas mennyiséget köthetünk ki a nanochipek felületére, rendkívüli
érzékenységgel bíró szenzorokat gyárthatunk.
 |
 |
 |
1. ábra. Balra egy baktérium és a mozgásához használt flagelláris filamentumok láthatóak. Középen a filamentum egy
kinagyított részlete, jobbra pedig az látható, hogy milyen fehérje egységekből (monomer) épül fel egy filamentum.
|
A kutatási fázisban lévő bioszenzorok fejlesztésénél szükséges, hogy a receptor réteg szilárd felületen (nanochipen)
kialakított struktúráját, stabilitását és szelektív kötőképességét megismerjük. Jelen példa esetében a flagelláris
filamentumok felületre történő leválasztásának és a felületi elrendeződésének tanulmányozása, jellemzése fontos lépés
a későbbi alkalmazások irányába.
Fehérjeoldatot szilárd hordozón áramoltatva a fehérje molekulák a felületre áramlanak, diffundálnak, majd a felületet
elérve arra letapadnak. A felület és a fehérje fizikai, kémiai tulajdonságaitól függően köztük gyenge másodlagos vagy
erősebb kovalens kötés is kialakulhat. Ahhoz, hogy a letapadt fehérjék következtében a felületen végbemenő változásokat
nanométeres (1 nm = 10-9 m) tartományban is pontosan tudjuk detektálni, nagyon érzékeny mérési eljárásra
van szükség. Továbbá célszerű a fehérje adszorpció folyamatát időben, és a fentebb említett okok miatt folyadék közegben
nyomon követni. Ehhez a mérések során olyan optikai módszert alkalmazunk, mely folyadékcella használatával képes a
felületen bekövetkező változásokat folyamat közben (in situ) érintés- és roncsolásmentesen detektálni.
A spektroszkópiai ellipszometria (SE) alkalmas ilyen in situ vizsgálatokra.
 |
2. ábra. Az MFA Ellipszometria Laboratórium (www.ellipszometria.hu)
Woollam M2000DI spektroszkópiai ellipszométere.
|
Az ellipszométer egy olyan mérőberendezés, mely a minta felületről visszavert fény polarizációs állapotának a megváltozását
tudja kimérni. Amikor a fény két eltérő törésmutatójú közeg határfelületéről verődik vissza, polarizációs állapota megváltozhat.
Ennek mértéke e két közeg anyagi minőségének függvénye. Az ellipszométer ezt a polarizációváltozást méri. A laboratóriumunkban
használt Woollam M2000DI spektroszkópiai ellipszométer (2. ábra) pontosságáról tipikusan elmondható, hogy segítségével
a vizsgáló fény hullámhosszának ezredével összemérhető vékonyréteg-vastagságok még nagy pontossággal detektálhatóak.
Alkalmasan kidolgozott réteg modellek segítségével meghatározható a felületre letapadt (adszorbeált) nanométeres vastagságú
fehérjeréteg számos fizikai tulajdonsága (réteg vastagsága, optikai sűrűsége) is. Ezen információk ismeretében már a felületre
letapadt összes anyagmennyiség is kiszámolható. Tehát az SE módszer alkalmazása olyan felületanalitikai és minősítő eljárás,
mely kulcsa a megbízható, reproduktív szenzorchipek kifejlesztésének.
A mérések során többnyire szilícium mintát használunk, melyet az ellipszométer tárgyasztalára helyezünk. A mintára olyan
kisméretű (0,2 ml térfogatú) folyadékcella rögzíthető, amelyben a fehérjeoldatot perisztaltikus pumpával áramoltatva,
a minta felületén történő változások a mérés kezdetétől a végéig folyamatosan nyomon követhetőek. A folyadékcellát
(3. ábra) az ellipszométer tárgyasztalán úgy állítjuk be, hogy a beeső fénynyaláb a cella első ablakán átjutva
megvilágíthassa a benne található mintát, majd erről visszaverődve a másik ablakon át a detektorba jusson.
 |
 |
3. ábra. Balra látható a folyadékcella 3D képe, jobbra pedig a 2D keresztmetszete a spektroszkópiai ellipszométer
vizsgáló fénynyalábjának megjelölésével.
|
Érdemes tehát a hordozórétegre történő fehérjeleválasztást folyadékcellában végezni. Így sokkal részletesebb képet
kaphatunk az immobilizációs eljárásról, és egyúttal annak paramétereit is tovább pontosíthatjuk.
Az MFA Nyári Iskola ideje alatt a diák kutatónak lehetősége lesz megismerkedni egy bio-nanotechnológiai kutatási
irányzattal, melynek célja érzékeny bioszenzorok fejlesztése. Saját kezűleg készítheti el a mérésekhez szükséges
oldatokat, lépésről-lépésre nyomonkövetheti az előkészítési folyamatokat. Majd az így elkészített mintákkal,
oldatokkal dolgozva nanométeres tartományba eső felületi változást tud megfigyelni érzékeny optikai módszerekkel.
A mérések során a spektroszkópiai ellipszométer beállításait, a folyadékcella pozícionálását számítógépen keresztül
fogja vezérelni, majd a mérést optikai modellek megalkotásával kiértékelni.
|
